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晶狀體上皮細胞光損傷與活性氧作用及TGF-β2/Smad3信號傳導通路的研究

晶狀體上皮細胞光損傷與活性氧作用及TGF-β2/Smad3信號傳導通路的研究

作者:師大云端圖書館 時間:2015-07-13 分類:開題報告 喜歡:3455
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【摘要】目的:白內障是全世界首位的致盲性眼病,雖然不同的損傷因子導致白內障的通路和機制各不相同,但是它們大多通過一共同的中間產物——活性氧,累積的光暴露誘發的活性氧自由基所導致的晶狀體上皮細胞凋亡與老年性白內障的發生關系密切,另外TGF-β2/Smad3信號傳導通路與白內障及晶狀體上皮細胞凋亡之間的關系得到越來越多的關注。本研究采用發光二極管(lightemittingdiode,LED)光源制作晶狀體上皮細胞(lensepithelialcell,LEC)光損傷模型,探討LEC光損傷與活性氧和TGF-β2/Smad3信號傳導通路之間的關系,本研究進一步觀察了具有活性氧清除作用的丹參素和阻斷TGF-β2/Smad3信號傳導通路對LED光源誘導人晶狀體上皮細胞光損傷所致凋亡的影響,進一步評價了活性氧和TGF-β2/Smad3信號傳導通路在以上過程中的作用。方法:本研究包括三部分:1.使用LED光源20000勒克斯照度Oh、6h、12h、24h照射LEC,使用流式細胞術檢測LEC內活性氧的表達及細胞凋亡情況,分別使用Real-timePCR和Westernblotting檢測BAX和TGF-β2mRNA和蛋白表達,使用四甲基噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖。2.在第一部分基礎上,使用具有活性氧清除功能的丹參素,觀察丹參素光照組和光照組LEC在LED光源20000勒克斯照度照射24h后,細胞內活性氧的表達、細胞凋亡率、BAX基因和BAX蛋白表達等各項指標的差異。3.以pSilencer2.1-U6neo為質粒載體,構建Smad3的siRNA表達質粒,轉化大腸桿菌、酶切、測序進行鑒定,利用siRNA阻斷Smad3信號傳導通路后,觀察其與對照組在LED光源20000勒克斯照度照射24h后,細胞凋亡率、BAX基因和BAX蛋白表達等各項指標的差異。結果:1.光照0h組、6h組、12h組、24h組LEC內活性氧平均熒光強度、早期凋亡率、總凋亡率隨光照時間的延長逐漸上升,且各組間差異有統計學意義(P<0.05)。光照6h、12h、24h組,BAX的mRNA表達較0h組分別升高約1.45倍、5.45倍和15.86倍,TGF-β2的mRNA表達分別升高約1.22倍、1.79倍和4.01倍,各組間表達差異有統計學意義(P<0.05)。光照24h組BAX和TGF-β2蛋白的表達量分別較0h組升高約1.85倍和2倍。MTT實驗0h組和24h組在570nm處的吸收值分別為0.991±0.014和0.858±0.032,兩組間差異有統計學意義(P<0.05)。2.光照組和丹參素光照組ROS平均熒光強度分別為15.83+5.81和7.67+0.63,兩組間差異具有統計學意義(t=2.882,P=0.034)。光照組和丹參素光照組HLEB-3細胞總凋亡率分別為5.22%±1.63%和1.57%±1.21%,兩組間差異有統計學意義(t=3.11P=0.036)。光照組BAX基因的表達水平是丹參素光照組的9.51±3.23倍,兩組間差異有統計學意義(t=-4.566,P=0.010)。光照組、對照組和丹參素光照組BAX蛋白條帶的校正后灰度值分別為0.297、0.065和0.100。MTT實驗光照組、對照組和丹參素光照組,在570nm處的吸收值A570分別為1.002±0.017、1.230±0.025、1.116±0.033,三組間比較差異有統計學意義(F=57.028,P<0.0001),且每兩組之間比較差異均有統計學意義P<0.05)。3.轉染Smad3siRNA光照組、轉染空載體光照組總凋亡率分別為2.04%±1.03%和5.80%±1.12%,兩組間差異有統計學意義(t=-4.298,P=0.013)。光照組BAX基因表達是轉染Smad3siRNA光照組的2.36±±0.57倍,兩組間差異有統計學意義(t=-4.111,P=0.015)。轉染空載體光照組BAX基因的表達是轉染Smad3siRNA光照組的3.10±0.76倍,兩組間差異有統計學意義(t=-4.804,P=0.041)。轉染Smad3siRNA光照組、轉染空載體光照組、光照組、對照組BAX蛋白條帶的校正后灰度值分別為0.193、,0.586、0.283、0.036。結論:1.隨光照時間的延長LEC活性氧含量、早期凋亡率、總凋亡率、BAX基因和蛋白表達、TGF-β2基因和蛋白表達升高,細胞增殖活性下降。TGF-β2可能參與了光誘導的LEC的活性氧損傷和細胞凋亡的過程。2.丹參素可以明顯降低光損傷誘導的人晶狀體上皮細胞內的活性氧水平,降低細胞凋亡的發生,丹參素對于光誘導的晶狀體上皮細胞損傷的保護作用可能是通過抑制細胞內活性氧的產生來實現的。3.TGF-β2/Smad3信號傳導通路參與了LED光源誘導的人晶狀體上皮細胞光損傷所導致的細胞凋亡的過程,且阻斷其作用對LED光源光損傷誘導的細胞凋亡有一定的抑制作用。
【作者】魏樹瑾;
【導師】湯欣;
【作者基本信息】天津醫科大學,眼科學(專業學位),2014,博士
【關鍵詞】晶狀體上皮細胞;光損傷;細胞凋亡;活性氧;TGF-β2;Smad3;丹參素;RNA干擾;

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