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大鼠miR-185-3p調控的TrkB.FL信號通路抑制神經元癇樣放電的研究

大鼠miR-185-3p調控的TrkB.FL信號通路抑制神經元癇樣放電的研究

作者:師大云端圖書館 時間:2015-07-13 分類:開題報告 喜歡:2335
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【摘要】研究目的:癲癇(Epilepsy)是一種常見的神經系統疾病,在研究癲癇發病機制的基礎上,探索抑制癲癇發作的有效途徑,具有重要的科學意義和臨床應用價值。本論文在癲癇發生的TrkB(tropomyosin-relatedkinaseB)受體和TrkB信號通路角度,以大鼠海馬神經元癇樣放電模型(spontaneousrecurrentepileptiformdischarges,SREDs)為研究對象,通過大鼠miR-185-3p(miR-185*)激活全長型TrkB(TrkB.FL)信號通路,研究神經元電壓門控性Ca2+通道(Voltage-gatedcalciumchannels,VGCCs)特性和癇樣放電的抑制情況。探討TrkB.FL信號通路激活后抑制癲癇發生的機制,為臨床治療癲癇提供創新的調控思路。研究方法:1.通過無鎂液處理原代培養的大鼠海馬神經元3h,構建神經元癇樣放電模型。2.研究TrkB受體和TrkB信號通路在癇樣放電模型中的變化機制。(1)通過實時熒光定量PCR和westernblotting檢測全長型TrkB(TrkB.FL)和截短型TrkB(TrkB.T)受體在模型中的表達水平,并應用鈣蛋白酶抑制劑和轉錄翻譯抑制劑研究調控TrkB受體表達變化的機制。(2)使用BDNF處理模型,應用westernblotting檢測磷酸化TrkB.FL受體蛋白的表達水平,研究模型中TrkB受體表達變化調控TrkB.FL信號通路活性的相關機制。3.研究miR-185*調控TrkB.FL信號通路活性后對癇樣放電的影響。(1)利用包含miR-185*-pGLVHl/GFP表達載體的慢病毒轉染模型,實時熒光定量PCR和westernblotting檢測TrkB.T受體表達和TrkB.FL信號通路活性的改變。(2)全細胞膜片鉗檢測miR-185*轉染模型中神經元VGCC電流和穩態激活與失活特性的變化。(3)全細胞膜片鉗檢測miR-185*轉染模型中神經元放電的頻率變化情況。4.應用翻譯抑制劑孵育癇樣放電模型,通過全細胞膜片鉗檢測神經元放電頻率的變化,研究TrkB.FL信號通路活性改變后對癇樣放電的影響。研究結果:1.大鼠海馬神經元癇樣放電模型的鑒定結果:與正常對照組神經元相比,模型組中神經元放電頻率顯著上升(P<0.001,n=9),inter-eventinterval累計分布曲線明顯左移(P<0.001,n=9)。2.TrkB受體和TrkB信號通路在癇樣放電模型中的變化結果:(1)在癇樣放電模型中,TrkB.T受體較正常對照組表達增加(P<0.001,n=6),TrkB.FL受體表達降低(P<0.001,n=6)。與模型組相比,鈣蛋白酶抑制劑孵育模型后,TrkB.FL受體表達上升(P<0.001,n=6);轉錄或翻譯抑制劑孵育模型后,TrkB.T受體表達均下降(P<0.001,n=6)。(2)與正常對照孵育BDNF組相比,BDNF處理癇樣放電模型,或者BDNF處理模型再孵育鈣蛋白酶抑制劑,以上兩組磷酸化的TrkB.FL受體蛋白與總TrkB.FL受體蛋白的比值(pTrkB.FL/totalTrkB.FL)均降低(P<0.01,n=6),證明TrkB.FL信號通路活性被抑制。而BDNF處理癇樣放電模型再孵育翻譯抑制劑后,與BDNF處理模型組相比,pTrkB.FL/totalTrkB.FL比值升高(P<0.001,n=6),TrkB.FL信號通路被激活。3.利用miR-185*調控TrkB.FL信號通路活性后影響癇樣放電的研究結果:(1)利用miR-185*轉染癇樣放電模型72h后,miR-185*在模型中持續大量的表達,并調控模型中TrkB.T受體表達減少(P<0.001,n=6)。miR-185*轉染癇樣放電模型后再經BDNF處理,與BDNF處理模型組相比,pTrkB.FL/totalTrkB.FL比值上升(P<0.001,n=4),TrkB.FL信號通路同樣被激活。(2)癇樣放電模型組中神經元VGCC電流和穩態激活與失活特性的相關參數與正常對照組比較后發現,VGCC最大電流密度升高(P<0.001,n=10-15);激活曲線的V1/2和斜率因子k顯著降低(P<0.001,n=7-10)。表示VGCC激活的閾電位減小,激活速度加快,通道相對容易被激活。模型組VGCC失活曲線的V1/2顯著增加(P<0.001,n=7-9),而斜率因子k卻顯著降低(P<0.001,n=7-9)。表示VGCC失活的閾電位增加,失活速度變慢,通道相對更難失活。而miR-185*轉染癇樣放電模型后,VGCC特性的相關參數與未經轉染的模型組相比,VGCC最大電流密度降低(P<0.001,n=10.15);激活曲線的V1/2顯著增加(P<0.01,n=7-10),斜率因子k也顯著升高(P<0.001,n=7-10)。表示VGCC激活的閾電位升高,激活速度降低,通道相對難以激活。而VGCC失活曲線的V1/2變化雖然降低,但不顯著(P>0.05,n=7-9),反而斜率因子k顯著升高(P<0.05,n=7-9),表明VGCC失活速度加快,通道相對更容易失活。(3)miR-185*轉染癇樣放電模型后,與未經處理的模型相比,神經元放電頻率顯著降低(P<0.001,n=9),其inter-eventinterval累計分布曲線右移(P<0.001,n=9),結果顯示轉染模型神經元的癇樣放電減弱。4.應用翻譯抑制劑孵育癇樣放電模型,TrkB.FL信號通路變化后對癇樣放電的調節結果:與未經處理的模型相比,翻譯抑制劑孵育模型后的神經元放電頻率顯著降低(P<0.001,n=9),inter-eventinterval累計分布曲線右移(P<0.001,n=9),神經元的癇樣放電同樣減弱。結論:1.大鼠海馬神經元經無鎂液處理3h后,成功構建癇樣放電模型。2.癇樣放電模型中,鈣蛋白酶調控TrkB.FL受體表達減少,轉錄翻譯過程參與TrkB.T受體表達的增加。TrkB.T受體的高表達抑制模型中TrkB.FL信號通路的激活。3.miR-185*激活TrkB.FL信號通路后,抑制癇樣放電的產生。(1)miR-185*轉染癇樣放電模型,通過下調TrkB.T受體的表達,可以激活TrkB.FL信號通路。(2)激活的TrkB.FL信號通路抑制miR-185*轉染模型神經元的VGCC電流和通道活性。(3)激活的TrkB.FL信號通路降低miR-185*轉染模型神經元的放電頻率。4.翻譯抑制劑孵育癇樣放電模型,激活的TrkB.FL信號通路同樣降低了神經元的放電頻率,最終抑制癇樣放電。
【作者】謝偉;
【導師】田心;
【作者基本信息】天津醫科大學,生物醫學工程,2014,博士
【關鍵詞】癲癇;癇樣放電SREDs;TrkB.FL信號通路;miR-185~*;翻譯抑制劑;TrkB.FL信號通路激活;抑制癲癇;

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